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Les méthodes de séparation d?une protéine
Les méthodes de séparation d’une protéine<o:p></o:p>
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I) Électrophorèse<o:p></o:p>
- Séparation selon la masse moléculaire avec un gel de polyacrylamide caractérisé par la réticulation (maillage)<o:p></o:p>
- Protéines migrent du haut vers le bas (plus une molécule est grosse moins elle migre)<o:p></o:p>
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1) Neutralisation des charges è pré-électrophorèse<o:p></o:p>
Casse toutes les liaisons (seule structure primaire reste)<o:p></o:p>
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2) Dénaturation protéique<o:p></o:p>
Rend toutes les protéines négatives grâce à :<o:p></o:p>
- un mélange de β-mercaptoethanol avec une protéine pour casser le pont disulfure<o:p></o:p>
- chauffage<o:p></o:p>
- ajout de SDS (détergent amphiphiles) rend toutes les protéines négatives<o:p></o:p>
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3) Identification des protéines<o:p></o:p>
On utilise des marqueurs dont on connaît le poids moléculaire<o:p></o:p>
On les colore avec du bleu de coomassie qui se fixe sur les résidus aromatiques<o:p></o:p>
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Immunogéinité (création d’anticorps contre la protéine) è Western blot<o:p></o:p>
- Sors protéine du gel grâce à un champ électrique sur membrane hydrophobe <o:p></o:p>
- Fixe protéine sur la partie basse de l’anticorps (sans modifier le rôle de l’anticorps) <o:p></o:p>
- Fixation de l’anticorps coloré dirigé contre l’anticorps fixant la protéine<o:p></o:p>
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4) Électrophorèse bidimensionnelle<o:p></o:p>
Utilise la charge et la masse moléculaire<o:p></o:p>
- Focalisation isoélectrique : sépare les molécules selon le pH de la forme zwitterrionique <o:p></o:p>
Quand charge nette = 0 il n’y a plus de migration<o:p></o:p>
Si pH alcalin (négative) / pH acide (positive)<o:p></o:p>
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II) Chromatographie<o:p></o:p>
1) Exclusion d’un gel<o:p></o:p>
Séparation par la taille è bille poreuse capture petit poids moléculaire<o:p></o:p>
Plus la molécule est grosse plus elle descend<o:p></o:p>
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2) Échangeurs d’ion<o:p></o:p>
Séparateur par charge nette (utilisation de NaCl)<o:p></o:p>
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III) Spectrométrie de masse<o:p></o:p>
Protéine ionisée par laser provoque un déplacement ± rapide dans un canon<o:p></o:p>
Les plus légers arrivent en premier sur la cellule de détection<o:p></o:p>
C’est une technique complémentaire à l’électrophorèse bidimensionnelle<o:p></o:p>
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