• Microscopie optique

    Microscopie optique<o:p></o:p>

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    I) Introduction<o:p></o:p>

    - La MO utilise le photon et sa résolution (= dmin entre 2 points pour que le microscope les différencie) est de 200nm.<o:p></o:p>

    - On doit fixer (=tuer) les cellules pour les observer, on utilise donc de la résine pour les observer, mais les cellules sont transparentes → on ne peut pas distinguer ce qui ce passe.<o:p></o:p>

    Ø  Utilisation de colorants : ↗ du contraste par ↘ de l’amplitude de l’onde → cliché de ȼ mortes.<o:p></o:p>

    Ø  Contraste de phase : ne tue pas les cellules, augmente le déphasage → on obtient des images grâce au contraste. On peut également faire de la microscopie time lapse pour visualiser le déplacement des ȼ.<o:p></o:p>

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    II) Microscopie à fluorescence<o:p></o:p>

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                A) Principe<o:p></o:p>

    - Toutes les molécules ne sont pas fluorescentes.<o:p></o:p>

    - Les molécules fluorescentes absorbent de l’énergie lumineuse (lumière d’absorption) et la restituent rapidement sous forme d’un rayonnement photonique (lumière d’émission) → Eabsorption > Eémission λémission > λabsorption<o:p></o:p>

    - Les marqueurs fluorescents (= fluorochromes) peuvent être associés directement ou indirectement à la structure cellulaire étudiée (pouvant être fixée ou vivante), et on peut combiner différents fluorochromes simultanément.<o:p></o:p>

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                B) Mécanisme<o:p></o:p>

    - La source de lumière blanche traverse un premier filtre qui ne laisse passer qu’une couleur selon la λ choisie.<o:p></o:p>

    - Puis la lumière arrive au miroir dichroïque, qui réfléchit ou laisse passer la lumière selon la λ → λtransmise > λréfléchie.<o:p></o:p>

    - Ensuite la lumière arrive sur l’échantillon, stimule les molécules fluorescentes qui émettent une lumière d’émission  de longueur d’onde supérieure, qui traverse le miroir dichroïque sans être déviée.<o:p></o:p>

    - La lumière atteint alors un deuxième filtre qui élimine les λ parasites et enfin le système oculaire.<o:p></o:p>

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                      C) Fluorescence naturelle : la GFP<o:p></o:p>

    - Possède des propriétés de fluorescence intrinsèques, absorbe le bleu et émet du vert marqueur universel.<o:p></o:p>

    - Structure en tonneau avec une triade d’aa en son centre (= chromophore, responsable de la fluorescence).<o:p></o:p>

                      → Chromophore de la GFP : glycine, tyrosine et thréonine (G, Y, T)<o:p></o:p>

    - On peut obtenir des variants de la GFP en modifiant la séquence de la triade (CFP, YFP, BFP...), et ainsi suivre plusieurs molécules différentes en les combinant.<o:p></o:p>

    - Molécules artificielles fluorescentes :<o:p></o:p>

    Ø  Fluorescéine : bleu → vert.<o:p></o:p>

    Ø  Rhodamine : vert → rouge.<o:p></o:p>

    → Possibilité de coupler Fluorescéine/Rhodamine et Rhodamine/GFP, mais pas Fluorescéine/GFP !<o:p></o:p>

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                D) Introduction de molécules fluorescentes dans la cellule<o:p></o:p>

    - Micro-injection : injection directe mais on traite les cellules une par une → long.<o:p></o:p>

    - Electroporation : choc électrique → trous transitoires dans la membrane → bcp de molécules entrent dans la ȼ.<o:p></o:p>

    - Vectorisation par vésicules : méthode la plus naturelle et la moins violente, fusion de vésicules contenant les molécules avec la membrane plasmique, mais le comportement de la ȼ peut être biaisé par cette introduction.<o:p></o:p>

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                E) Exprimer un gène codant pour une molécule fluorescente<o:p></o:p>

    - Possible seulement pour des protéines telles que la GFP.<o:p></o:p>

    - On introduit un gène artificiel codant pour la GFP avec un promoteur, nécessaire pour la transcription → le gène est reconnu par l’ARN polymérase → transcription en ARNm puis traduction en protéine GFP.<o:p></o:p>

    - Ainsi, on peut greffer le gène de la GFP au gène de la protéine qui nous intéresse → gène hybride, toujours avec un promoteur → après transcription et traduction, on aura une protéine qui déplacera la fluorescence avec elle.<o:p></o:p>

    Ø  Si on observe une fluorescence au niveau de la membrane plasmique, on SUGGERE que la protéine X est membranaire car il n’est pas impossible que la protéine GFP-X modifie les propriétés de la protéine naturelle X.<o:p></o:p>

    Ø  En revanche, on DEMONTRE que la protéine GFP-X est membranaire.<o:p></o:p>

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    III) Applications de la fluorescence<o:p></o:p>

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                A) FRET<o:p></o:p>

    - Transfert d’énergie non radiatif (= sans émission de lumière) entre 2 molécules très proches (d < 10nm).<o:p></o:p>

    - Spectre d’émission de la molécule donneuse doit au moins chevaucher le spectre d’absorption de la receveuse.<o:p></o:p>

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    - FRET intermoléculaire → étude des interactions entre 2 molécules.<o:p></o:p>

    - FRET intramoléculaire → étude de la conformation spatiale d’une molécule (sonde calcique caméléon, qui mesure la concentration intracellulaire de calcium).<o:p></o:p>

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                B) FRAP<o:p></o:p>

    - Photoblanchiment (= irradiation qui tue irréversiblement la fluorescence) temporaire dans une zone de la cellule → fluo réapparait progressivement au même endroit car les protéines de la ȼ recolonisent la zone irradiée.<o:p></o:p>

    - Etude de la vitesse de déplacement des molécules en IC, dont dépend la vitesse de recoloration/recolonisation.<o:p></o:p>

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                C) FLIP<o:p></o:p>

    - Photoblanchiment continu → la fluo diminue au cours du temps et devient nulle, car la fluo des protéines qui recolonisent la zone irradiée se fait tuer.<o:p></o:p>

    - Aussi une mesure de la vitesse de déplacement/diffusion des protéines en IC.<o:p></o:p>

                      → Technique permettant de voir si les protéines d’intérêt ont la capacité de changer de compartiment.<o:p></o:p>

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    IV) Fluorescence induite<o:p></o:p>

    - Molécule non fluo naturellement mais qui le devient une fois fixée à la molécule étudiée.<o:p></o:p>

    - Visualisation des acides nucléiques<o:p></o:p>

    Ø  Fixation sur les paires de bases → Hoechst et DAPI sur les bases A-T.<o:p></o:p>

    Ø  Intercalant sur la double hélice → iodure de propidium et bromure d’éthidium.<o:p></o:p>

    ·       Hétérochromatine = coloration intense = ADN condensé = peu d’expression génique.<o:p></o:p>

    ·       Euchromatine = faible coloration = ADN ouvert = expression génique importante.<o:p></o:p>

    ·       Nucléole = zone non colorée = PAS D’ADN !<o:p></o:p>

    - Visualisation de la concentration de calcium intracellulaire<o:p></o:p>

    Ø  Protéine Fura-2 qui devient fluo en fixant du calcium et dont la fluo augmente proportionnellement à [Ca2+].<o:p></o:p>

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    V) Immunofluorescence indirecte<o:p></o:p>

    - Utilisation d’Ac fluorescents qui vont se fixer sur la protéine d’intérêt, permettent de l’observer.<o:p></o:p>

    - Immunité :<o:p></o:p>

    Ø  Innée/non spécifique = 1ère barrière de défense.<o:p></o:p>

    Ø  Adaptative/spécifique = Ac dirigé contre un Ag → complexe immun, phagocyté par les macrophages.<o:p></o:p>

    - Deux types d’Ac :<o:p></o:p>

    ·       Ac polyclonaux : Ac différents reconnaissant le même Ag mais se fixant sur des épitopes différents.<o:p></o:p>

    ·       Ac monoclonal : meilleur ciblage → meilleure détermination du complexe Ac-Ag car reconnaissance d’un unique épitope.<o:p></o:p>

    /!\ Un Ac est spécialisé d’un seul épitope (= zone d’une protéine reconnaissable par un Ac) /!\<o:p></o:p>

    ·       LB + ȼ de myélome (immortelles) → cellules hybrides immortelles → immortalité des clones produisant les Ac → milieu HAT, test du puits → production d’Ac monoclonaux infinie après sélection positive avec l’Ag.<o:p></o:p>

    - Principe de l’immunofluorescence indirecte :<o:p></o:p>

    ü  Si Ac primaires (provenant d’espèces différentes) non fluorescents → utilisation d’anti-Ac secondaires (différents de l’Ac primaire), greffés à des fluorochromes différents (ex : fluorescéine/rhodamine).<o:p></o:p>

    ü  Limites : protéine transmembranaire = reconnaissance par les Ac sans traitement.<o:p></o:p>

                       protéine IC = incapacité des Ac à entrer dans la cellule → utilisation de détergents pour fixer la ȼ.<o:p></o:p>

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    VI) FISH (Fluorescence In Situ Hybridation) → application à l’ADN et à l’ARN !<o:p></o:p>

    - Il est difficile de localiser de l’ADN car il n’y a pas d’anticorps anti-ADN spécifiques (un anticorps ne pourra pas reconnaitre spécifiquement la séquence d’un gène donné). <o:p></o:p>

    ·       L’ADN formé d’un double brin doit d’abord être dénaturé (on défait les 2 brins grâce à la chaleur, à la formamide ou à la soude), puis on introduit une sonde fluorescente, qui possède la séquence en nucléotide complémentaire du gène que l’on cherche à localiser fixation à sa moitié complémentaire = hybridation.<o:p></o:p>

    ·       ARN : pas d’étape de dénaturation car l’ARN n’a qu’un seul brin on utilise le brin anti-sens de l’ARN. <o:p></o:p>

     

    Comment rendre la sonde fluorescente ?<o:p></o:p>

    On peut greffer des fluorochromes aux nucléotides, ou un Ag reconnu par un Ac marqué par un fluorochrome.<o:p></o:p>

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    - On effectue les hybridations sur des chromosomes métaphasique, que l’on observe ensuite car ils sont très condensés.<o:p></o:p>

    ü  Le centromère est la partie reliant les 2 chromatides, constituées de chromatine !<o:p></o:p>

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    VII) Microscopie confocale<o:p></o:p>

    Principe : la lumière d’émission passe dans un diaphragme (= pinhole) qui élimine la lumière hors champ focal, puis le microscope, par l’acquisition de plusieurs plans confocaux, génère des images en 3D par reconstitution.<o:p></o:p>

    - Résolution améliorée (~1μm) et les coupes d’échantillons peuvent être visualisées en 3D et plus épaisses.<o:p></o:p>

     

     

     

     

    VIII) Microscopie à super résolution<o:p></o:p>

    - Excitation séquentielle de différents fluorochromes (qui clignotent), puis le microscope enregistre toutes les fluctuations de fluorescence en temps réel.<o:p></o:p>

    - Améliore la résolution jusqu’au nm.<o:p></o:p>

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    Microscopie électronique<o:p></o:p>

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    I) Généralités<o:p></o:p>

    ·       Résolution de 0.2 nm<o:p></o:p>

    ·       Etude des molécules et des atomes <o:p></o:p>

    ·       Non applicable aux cellules vivantes <o:p></o:p>

    ·       Les échantillons sont fixés, déshydratés, séchés, inclus dans une résine, vaporisés par des sels de métaux lourds (pour augmenter le contraste) et coupés à l’ultramicrotome (= coupes ultrafines).<o:p></o:p>

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    II) ME à balayage<o:p></o:p>

    - Permet d’étudier la surface d’une cellule.<o:p></o:p>

    - Les électrons ne traversent pas la préparation mais y sont réfléchis.<o:p></o:p>

    - Dans certaines conditions on peut observer les cellules vivantes.<o:p></o:p>

    - Résolution moins bonne mais les échantillons peuvent-être plus épais et en 3D.<o:p></o:p>

     

     

     

    III) ME à transmission<o:p></o:p>

    Principe :<o:p></o:p>

    ü  Des électrons sont produits par un canon et sont concentrés dans un condenseur vers l’échantillon sous vide.<o:p></o:p>

    ü  Puis ils traversent l’échantillon et atteignent un écran fluorescent. <o:p></o:p>

    ü  Les électrons ont un pouvoir de pénétration inférieur à celui des protons. On fera donc des coupes ultrafines.<o:p></o:p>

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                A) Marquage à l’or<o:p></o:p>

    L’échantillon est mis en présence d’Ac, couplés à des particules d’or, dirigés contre l’Ag à étudier.<o:p></o:p>

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                B) Cryomicroscopie<o:p></o:p>

    - L’échantillon est congelé dans de l’azote liquide, puis fracturé en bloc sous vide : c’est la cryofracture.<o:p></o:p>

    - On dissocie 2 feuillets membranaires, les protéines membranaires vont rester accrochées à un des deux feuillets et on pourra les observer.<o:p></o:p>

    - Coloration par ombrage pour visualiser la surface de la membrane.<o:p></o:p>

     

    Avantage :<o:p></o:p>

    Ø  Echantillon sous vide mais hydraté augmente le contraste visualisation des membranes des organites ou de l’enveloppe nucléaire.<o:p></o:p>

    Ø  Pas de fixation chimique = pas de dénaturation.<o:p></o:p>

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    Microscopie à force atomique<o:p></o:p>

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    - On l’utilise pour visualiser les surfaces d’un échantillon.<o:p></o:p>

    - Plus la pointe est fine, plus la résolution sera bonne.<o:p></o:p>

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    Principe : une pointe très fine balaie la surface de l’échantillon sans rentrer en contact avec celui-ci grâce à des forces de répulsion entre les atomes → la pointe va changer de direction : c’est la déflexion.<o:p></o:p>

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    Avantages : <o:p></o:p>

    Ø  Permet d’avoir une image 3D.<o:p></o:p>

    Ø  L’échantillon n’est pas mis sous vide.<o:p></o:p>

    Ø  Pas besoin de coloration.<o:p></o:p>

    Ø  La cellule peut être vivante ou morte.<o:p></o:p>

    Ø  Non destructif.<o:p></o:p>


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