Microscopie optique

14.08.2014

Microscopie optique<o:p></o:p>

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I) Introduction<o:p></o:p>

- La MO utilise le photon et sa résolution (= d_min entre 2 points pour que le microscope les différencie) est de 200nm.<o:p></o:p>

- On doit fixer (=tuer) les cellules pour les observer, on utilise donc de la résine pour les observer, mais les cellules sont transparentes → on ne peut pas distinguer ce qui ce passe.<o:p></o:p>

Ø Utilisation de colorants : â†— du contraste par â†˜ de l’amplitude de l’onde → cliché de È¼ mortes.<o:p></o:p>

Ø Contraste de phase : ne tue pas les cellules, augmente le déphasage → on obtient des images grâce au contraste. On peut également faire de la microscopie time lapse pour visualiser le déplacement des È¼.<o:p></o:p>

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II) Microscopie à fluorescence<o:p></o:p>

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A) Principe<o:p></o:p>

- Toutes les molécules ne sont pas fluorescentes.<o:p></o:p>

- Les molécules fluorescentes absorbent de l’énergie lumineuse (lumière d’absorption) et la restituent rapidement sous forme d’un rayonnement photonique (lumière d’émission) → E_absorption > E_émission → λ_émission > λ_absorption<o:p></o:p>

- Les marqueurs fluorescents (= fluorochromes) peuvent être associés directement ou indirectement à la structure cellulaire étudiée (pouvant être fixée ou vivante), et on peut combiner différents fluorochromes simultanément.<o:p></o:p>

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B) Mécanisme<o:p></o:p>

- La source de lumière blanche traverse un premier filtre qui ne laisse passer qu’une couleur selon la λ choisie.<o:p></o:p>

- Puis la lumière arrive au miroir dichroïque, qui réfléchit ou laisse passer la lumière selon la λ → λ_transmise > λ_réfléchie.<o:p></o:p>

- Ensuite la lumière arrive sur l’échantillon, stimule les molécules fluorescentes qui émettent une lumière d’émission de longueur d’onde supérieure, qui traverse le miroir dichroïque sans être déviée.<o:p></o:p>

- La lumière atteint alors un deuxième filtre qui élimine les λ parasites et enfin le système oculaire.<o:p></o:p>

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C) Fluorescence naturelle : la GFP<o:p></o:p>

- Possède des propriétés de fluorescence intrinsèques, absorbe le bleu et émet du vert → marqueur universel.<o:p></o:p>

- Structure en tonneau avec une triade d’aa en son centre (= chromophore, responsable de la fluorescence).<o:p></o:p>

→ Chromophore de la GFP : glycine, tyrosine et thréonine (G, Y, T)<o:p></o:p>

- On peut obtenir des variants de la GFP en modifiant la séquence de la triade (CFP, YFP, BFP...), et ainsi suivre plusieurs molécules différentes en les combinant.<o:p></o:p>

- Molécules artificielles fluorescentes :<o:p></o:p>

Ø Fluorescéine : bleu → vert.<o:p></o:p>

Ø Rhodamine : vert → rouge.<o:p></o:p>

→ Possibilité de coupler Fluorescéine/Rhodamine et Rhodamine/GFP, mais pas Fluorescéine/GFP !<o:p></o:p>

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D) Introduction de molécules fluorescentes dans la cellule<o:p></o:p>

- Micro-injection : injection directe mais on traite les cellules une par une → long.<o:p></o:p>

- Electroporation : choc électrique → trous transitoires dans la membrane → bcp de molécules entrent dans la È¼.<o:p></o:p>

- Vectorisation par vésicules : méthode la plus naturelle et la moins violente, fusion de vésicules contenant les molécules avec la membrane plasmique, mais le comportement de la È¼ peut être biaisé par cette introduction.<o:p></o:p>

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E) Exprimer un gène codant pour une molécule fluorescente<o:p></o:p>

- Possible seulement pour des protéines telles que la GFP.<o:p></o:p>

- On introduit un gène artificiel codant pour la GFP avec un promoteur, nécessaire pour la transcription → le gène est reconnu par l’ARN polymérase → transcription en ARNm puis traduction en protéine GFP.<o:p></o:p>

- Ainsi, on peut greffer le gène de la GFP au gène de la protéine qui nous intéresse → gène hybride, toujours avec un promoteur → après transcription et traduction, on aura une protéine qui déplacera la fluorescence avec elle.<o:p></o:p>

Ø Si on observe une fluorescence au niveau de la membrane plasmique, on SUGGERE que la protéine X est membranaire car il n’est pas impossible que la protéine GFP-X modifie les propriétés de la protéine naturelle X.<o:p></o:p>

Ø En revanche, on DEMONTRE que la protéine GFP-X est membranaire.<o:p></o:p>

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III) Applications de la fluorescence<o:p></o:p>

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A) FRET<o:p></o:p>

- Transfert d’énergie non radiatif (= sans émission de lumière) entre 2 molécules très proches (d < 10nm).<o:p></o:p>

- Spectre d’émission de la molécule donneuse doit au moins chevaucher le spectre d’absorption de la receveuse.<o:p></o:p>

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- FRET intermoléculaire → étude des interactions entre 2 molécules.<o:p></o:p>

- FRET intramoléculaire → étude de la conformation spatiale d’une molécule (sonde calcique caméléon, qui mesure la concentration intracellulaire de calcium).<o:p></o:p>

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B) FRAP<o:p></o:p>

- Photoblanchiment (= irradiation qui tue irréversiblement la fluorescence) temporaire dans une zone de la cellule → fluo réapparait progressivement au même endroit car les protéines de la È¼ recolonisent la zone irradiée.<o:p></o:p>

- Etude de la vitesse de déplacement des molécules en IC, dont dépend la vitesse de recoloration/recolonisation.<o:p></o:p>

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C) FLIP<o:p></o:p>

- Photoblanchiment continu → la fluo diminue au cours du temps et devient nulle, car la fluo des protéines qui recolonisent la zone irradiée se fait tuer.<o:p></o:p>

- Aussi une mesure de la vitesse de déplacement/diffusion des protéines en IC.<o:p></o:p>

→ Technique permettant de voir si les protéines d’intérêt ont la capacité de changer de compartiment.<o:p></o:p>

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IV) Fluorescence induite<o:p></o:p>

- Molécule non fluo naturellement mais qui le devient une fois fixée à la molécule étudiée.<o:p></o:p>

- Visualisation des acides nucléiques<o:p></o:p>

Ø Fixation sur les paires de bases → Hoechst et DAPI sur les bases A-T.<o:p></o:p>

Ø Intercalant sur la double hélice → iodure de propidium et bromure d’éthidium.<o:p></o:p>

· Hétérochromatine = coloration intense = ADN condensé = peu d’expression génique.<o:p></o:p>

· Euchromatine = faible coloration = ADN ouvert = expression génique importante.<o:p></o:p>

· Nucléole = zone non colorée = PAS D’ADN !<o:p></o:p>

- Visualisation de la concentration de calcium intracellulaire<o:p></o:p>

Ø Protéine Fura-2 qui devient fluo en fixant du calcium et dont la fluo augmente proportionnellement à [Ca²⁺].<o:p></o:p>

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V) Immunofluorescence indirecte<o:p></o:p>

- Utilisation d’Ac fluorescents qui vont se fixer sur la protéine d’intérêt, permettent de l’observer.<o:p></o:p>

- Immunité :<o:p></o:p>

Ø Innée/non spécifique = 1ère barrière de défense.<o:p></o:p>

Ø Adaptative/spécifique = Ac dirigé contre un Ag → complexe immun, phagocyté par les macrophages.<o:p></o:p>

- Deux types d’Ac :<o:p></o:p>

· Ac polyclonaux : Ac différents reconnaissant le même Ag mais se fixant sur des épitopes différents.<o:p></o:p>

· Ac monoclonal : meilleur ciblage → meilleure détermination du complexe Ac-Ag car reconnaissance d’un unique épitope.<o:p></o:p>

/!\ Un Ac est spécialisé d’un seul épitope (= zone d’une protéine reconnaissable par un Ac) /!\<o:p></o:p>

· LB + È¼ de myélome (immortelles) → cellules hybrides immortelles → immortalité des clones produisant les Ac → milieu HAT, test du puits → production d’Ac monoclonaux infinie après sélection positive avec l’Ag.<o:p></o:p>

- Principe de l’immunofluorescence indirecte :<o:p></o:p>

ü Si Ac primaires (provenant d’espèces différentes) non fluorescents → utilisation d’anti-Ac secondaires (différents de l’Ac primaire), greffés à des fluorochromes différents (ex : fluorescéine/rhodamine).<o:p></o:p>

ü Limites : protéine transmembranaire = reconnaissance par les Ac sans traitement.<o:p></o:p>

protéine IC = incapacité des Ac à entrer dans la cellule → utilisation de détergents pour fixer la È¼.<o:p></o:p>

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VI) FISH (Fluorescence In Situ Hybridation) → application à l’ADN et à l’ARN !<o:p></o:p>

- Il est difficile de localiser de l’ADN car il n’y a pas d’anticorps anti-ADN spécifiques (un anticorps ne pourra pas reconnaitre spécifiquement la séquence d’un gène donné). <o:p></o:p>

· L’ADN formé d’un double brin doit d’abord être dénaturé (on défait les 2 brins grâce à la chaleur, à la formamide ou à la soude), puis on introduit une sonde fluorescente, qui possède la séquence en nucléotide complémentaire du gène que l’on cherche à localiser → fixation à sa moitié complémentaire = hybridation.<o:p></o:p>

· ARN : pas d’étape de dénaturation car l’ARN n’a qu’un seul brin → on utilise le brin anti-sens de l’ARN. <o:p></o:p>

Comment rendre la sonde fluorescente ?<o:p></o:p>

→ On peut greffer des fluorochromes aux nucléotides, ou un Ag reconnu par un Ac marqué par un fluorochrome.<o:p></o:p>

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- On effectue les hybridations sur des chromosomes métaphasique, que l’on observe ensuite car ils sont très condensés.<o:p></o:p>

ü Le centromère est la partie reliant les 2 chromatides, constituées de chromatine !<o:p></o:p>

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VII) Microscopie confocale<o:p></o:p>

Principe : la lumière d’émission passe dans un diaphragme (= pinhole) qui élimine la lumière hors champ focal, puis le microscope, par l’acquisition de plusieurs plans confocaux, génère des images en 3D par reconstitution.<o:p></o:p>

- Résolution améliorée (~1μm) et les coupes d’échantillons peuvent être visualisées en 3D et plus épaisses.<o:p></o:p>

VIII) Microscopie à super résolution<o:p></o:p>

- Excitation séquentielle de différents fluorochromes (qui clignotent), puis le microscope enregistre toutes les fluctuations de fluorescence en temps réel.<o:p></o:p>

- Améliore la résolution jusqu’au nm.<o:p></o:p>

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Microscopie électronique<o:p></o:p>

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I) Généralités<o:p></o:p>

· Résolution de 0.2 nm<o:p></o:p>

· Etude des molécules et des atomes <o:p></o:p>

· Non applicable aux cellules vivantes <o:p></o:p>

· Les échantillons sont fixés, déshydratés, séchés, inclus dans une résine, vaporisés par des sels de métaux lourds (pour augmenter le contraste) et coupés à l’ultramicrotome (= coupes ultrafines).<o:p></o:p>

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II) ME à balayage<o:p></o:p>

- Permet d’étudier la surface d’une cellule.<o:p></o:p>

- Les électrons ne traversent pas la préparation mais y sont réfléchis.<o:p></o:p>

- Dans certaines conditions on peut observer les cellules vivantes.<o:p></o:p>

- Résolution moins bonne mais les échantillons peuvent-être plus épais et en 3D.<o:p></o:p>

III) ME à transmission<o:p></o:p>

Principe :<o:p></o:p>

ü Des électrons sont produits par un canon et sont concentrés dans un condenseur vers l’échantillon sous vide.<o:p></o:p>

ü Puis ils traversent l’échantillon et atteignent un écran fluorescent. <o:p></o:p>

ü Les électrons ont un pouvoir de pénétration inférieur à celui des protons. On fera donc des coupes ultrafines.<o:p></o:p>

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A) Marquage à l’or<o:p></o:p>

L’échantillon est mis en présence d’Ac, couplés à des particules d’or, dirigés contre l’Ag à étudier.<o:p></o:p>

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B) Cryomicroscopie<o:p></o:p>

- L’échantillon est congelé dans de l’azote liquide, puis fracturé en bloc sous vide : c’est la cryofracture.<o:p></o:p>

- On dissocie 2 feuillets membranaires, les protéines membranaires vont rester accrochées à un des deux feuillets et on pourra les observer.<o:p></o:p>

- Coloration par ombrage pour visualiser la surface de la membrane.<o:p></o:p>

Avantage :<o:p></o:p>

Ø Echantillon sous vide mais hydraté → augmente le contraste → visualisation des membranes des organites ou de l’enveloppe nucléaire.<o:p></o:p>

Ø Pas de fixation chimique = pas de dénaturation.<o:p></o:p>

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Microscopie à force atomique<o:p></o:p>

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- On l’utilise pour visualiser les surfaces d’un échantillon.<o:p></o:p>

- Plus la pointe est fine, plus la résolution sera bonne.<o:p></o:p>

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Principe : une pointe très fine balaie la surface de l’échantillon sans rentrer en contact avec celui-ci grâce à des forces de répulsion entre les atomes → la pointe va changer de direction : c’est la déflexion.<o:p></o:p>

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Avantages : <o:p></o:p>

Ø Permet d’avoir une image 3D.<o:p></o:p>

Ø L’échantillon n’est pas mis sous vide.<o:p></o:p>

Ø Pas besoin de coloration.<o:p></o:p>

Ø La cellule peut être vivante ou morte.<o:p></o:p>

Ø Non destructif.<o:p></o:p>