Les méthodes de séparation d?une protéine

Les méthodes de séparation d’une protéine<o:p></o:p>

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I)            Électrophorèse<o:p></o:p>

- Séparation selon la masse moléculaire avec un gel de polyacrylamide caractérisé par la réticulation (maillage)<o:p></o:p>

- Protéines migrent du haut vers le bas (plus une molécule est grosse moins elle migre)<o:p></o:p>

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1)  Neutralisation des charges è pré-électrophorèse<o:p></o:p>

Casse toutes les liaisons (seule structure primaire reste)<o:p></o:p>

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2)  Dénaturation protéique<o:p></o:p>

Rend toutes les protéines négatives grâce à :<o:p></o:p>

- un mélange de β-mercaptoethanol avec une protéine pour casser le pont disulfure<o:p></o:p>

- chauffage<o:p></o:p>

- ajout de SDS (détergent amphiphiles) rend toutes les protéines négatives<o:p></o:p>

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3)  Identification des protéines<o:p></o:p>

On utilise des marqueurs dont on connaît le poids moléculaire<o:p></o:p>

On les colore avec du bleu de coomassie qui se fixe sur les résidus aromatiques<o:p></o:p>

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            Immunogéinité (création d’anticorps contre la protéine) è Western blot<o:p></o:p>

- Sors protéine du gel grâce à un champ électrique sur membrane hydrophobe <o:p></o:p>

- Fixe protéine sur la partie basse de l’anticorps (sans modifier le rôle de l’anticorps) <o:p></o:p>

- Fixation de l’anticorps coloré dirigé contre l’anticorps fixant la protéine<o:p></o:p>

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4)  Électrophorèse bidimensionnelle<o:p></o:p>

Utilise la charge et la masse moléculaire<o:p></o:p>

- Focalisation isoélectrique : sépare les molécules selon le pH de la forme zwitterrionique <o:p></o:p>

Quand charge nette = 0 il n’y a plus de migration<o:p></o:p>

Si pH alcalin (négative) / pH acide (positive)<o:p></o:p>

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II)         Chromatographie<o:p></o:p>

1)  Exclusion d’un gel<o:p></o:p>

Séparation par la taille è bille poreuse capture petit poids moléculaire<o:p></o:p>

Plus la molécule est grosse plus elle descend<o:p></o:p>

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2)  Échangeurs d’ion<o:p></o:p>

Séparateur par charge nette (utilisation de NaCl)<o:p></o:p>

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III)      Spectrométrie de masse<o:p></o:p>

Protéine ionisée par laser provoque un déplacement ± rapide dans un canon<o:p></o:p>

Les plus légers arrivent en premier sur la cellule de détection<o:p></o:p>

C’est une technique complémentaire à l’électrophorèse bidimensionnelle<o:p></o:p>

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